篩選穩定細胞株的兩種方法

　　穩轉細胞系（穩定表達細胞株）指在細胞中持續穩定表達特定基因或干擾特定基因表達。穩轉細胞株的目的基因質粒DNA整合到細胞染色體上，使細胞長期穩定表達該基因。穩轉細胞株包括多克隆穩轉細胞株和單克隆穩轉細胞株。慢病毒感染目的細胞后，通過抗性基因篩選得到的細胞株是多個細胞克隆的組合。單克隆細胞株是從多克隆細胞中經細胞克隆挑選得到的，由一個細胞擴增得到的細胞株。單克隆細胞株性狀統一，傳代過程中細胞的基因表達保持穩定。
 

　　

　　篩選穩定細胞株的兩種方法：

　　

　　1、轉染質粒后，單克隆方法篩選穩定細胞系

　　

　　對大多數細胞轉染效率較低。對于基因過表達，如果轉染效率達到40%，基因過表達尚可。但是對于基因干擾實驗，對轉染效率要求遠遠高于基因過表達，通常質粒轉染無法滿足。

　　

　　另外，質粒游離于細胞質中，很快降解，無法滿足較長時間的檢測項目；質粒轉染整合幾率極低，穩定細胞株構建耗時耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。

　　

　　2、病毒感染篩選穩定細胞株

　　

　　病毒感染方法較質粒轉染篩選單克隆方法更方便和高效，是目前主流的穩定細胞系篩選方法。用慢病毒制備穩轉細胞株，由于其高效整合、高效轉錄、高效表達、宿主范圍廣，感染效率高，且與細胞染色體整合而不發生基因重排，是制備穩定細胞株的理想載體。

　　

　　穩定轉染細胞株服務流程：

　　

　　1、載體構建：將外源基因構建到合適的載體上，如需病毒轉染，則包裝病毒。

　　

　　2、篩選濃度測定：以10-14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。

　　

　　3、細胞接種：轉染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞應達到60%-80%覆蓋。

　　

　　4、細胞轉染：用構建好的載體（或包裝好的病毒）轉染目的細胞。

　　

　　5、抗生素篩選。

　　

　　6、鑒定篩選結果。