小鼠原代海馬神經元細胞的分離培養方法

海馬體主要負責記憶和學習，日常生活中的短期記憶都儲存在海馬體中。神經元是構成神經系統結構和功能的基本單位。神經元具有長突起，由細胞體和細胞突起構成。

       小鼠海馬神經元細胞的組織來源于實驗小鼠的正常腦組織，因為海馬神經元細胞類似于干細胞屬于高分度分化的細胞特性，具有不能傳代，不能增殖等特點，所有收到細胞后盡快使用。

       1.試驗所需儀器設備及試劑

       （1）儀器

        生物安全柜

        CO₂細胞培養箱

        熒光倒置顯微鏡

        高速冷凍離心機

        電熱恒溫鼓風干燥箱

       （2）試劑耗材

         T25細胞培養瓶

         血球計數板

         細胞培養孔板

         紅細胞裂解液

         神經元*培養基

         0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）

         多聚甲醛（PFA）

         DAPI

         Triton X-100

         山羊血清

         NSE

         Goat anti-Rabbit lgG（H+L）

         Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594

         Fluoromount-G熒光封片劑

       2.分離培養方法

         1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，

         2) 在冰浴的PBS中分離海馬，PBS洗滌3次，剪碎，

         3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化30min，

         4) 用FBS終止消化，輕輕吹打，

         5) 過100 μm 濾網，

         6) 收集濾液，300 g離心5 min，

         7) 用*培養基重懸沉淀，鋪瓶。

        3.免疫熒光

        3.1.實驗步驟 

      （1）細胞爬片

        取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養基1mL，加入細胞0.02million個/孔。置培養箱2h或過夜。

      （2）固定

        細胞爬片后，吸出培養基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS，放4℃過夜。

      （3）破膜封閉

        將玻片除去水分，置于培養皿支撐物上，

        玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，

        取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細胞的一面蓋上2h。

      （4）一抗孵育

        一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋

        破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細胞的一面）蓋上置于4℃（多可放置一周）

      （5）二抗孵育

       室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

     （6）包埋

       玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細胞的一面蓋上。

       鑒定細胞為P1代細胞

       3.2.檢測結果 

     （1）細胞免疫熒光鑒定照片

       陰性

                           100X-DAPI                                             100X-Fluorescence

       NSE

                             100X-DAPI                                          100X-Fluorescence

       （2）檢驗基本情況：

        經免疫熒光鑒定，該細胞純度達到90%以上。